样品处理
1．如果是新收集的细胞，须用1×PBS洗涤2次，4-20℃，1600-3000 rpm，3 min。最后一次将上清吸走。如果是冻存于-80℃的细胞，可直接取出放置在冰上备用。
2．按如下方法进行操作：
收集的细胞或组织，加入适量RIPA裂解液在使用前数分钟内按1：100加入蛋白酶抑制剂，如需研究磷酸化蛋白需要额外加入磷酸酶抑制剂[货号：GRF102]），涡旋振荡数秒，冰上放置30 min，间或振荡，直至充分裂解，高速低温离心（4℃，12000 g，15 min），将上清液转移到无菌离心管中备用（如蛋白不能及时使用，可以冻存于-80℃保存）。
3．每孔加入蛋白液/标准品20μL。将试剂蛋白定量试剂盒 A液:B液（50:1）配比混匀后，加入200μL至每孔。37℃烘箱中孵育30分钟或室温1小时。放置到酶标仪中测浓度【single wavelength 562nm】r2大于0.99为最好结果。测好浓度的蛋白分装放于-80℃保存。
BCA蛋白定量试剂盒和Bradford蛋白定量试剂盒。使用RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到的样品的蛋白浓度。
将BSA标准品用PBS稀释成一系列浓度梯度：
Vial | Volume of Diluent | Volume and source of BSA | Final BSA Concentration |
A | 0 | 300μL of Stock | 2000μg/mL |
B | 125 | 375μL of Stock | 1500μg/mL |
C | 325 | 325μL of Stock | 1000μg/mL |
D | 175 | 175μL of vial B dilution | 750μg/mL |
E | 325 | 325μL of vial C dilution | 500μg/mL |
F | 325 | 325μL of vial E dilution | 250μg/mL |
G | 325 | 325μL of vial F dilution | 125μg/mL |
H | 400 | 100μL of vial G dilution | 25μg/mL |
I | 400 | 0 | 0μg/mL=Blank |
配胶
1.将测好浓度的蛋白液与上样缓冲液一起混匀后，放入100℃水浴5-6 min。离心，放置冰上，待上样。（Tips：煮过的样品可以在-20℃条件下长期保存）
2.配制PAGE胶。
6% | 8% | 10% | 12% | 15% | |
Water | 5.4 | 4.7 | 4.1 | 3.4 | 2.4 |
Bis/Acryl. 30% | 2.0 | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 |
4×Tris.HCl/ SDS (1.5M, pH 8.8) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
10% Ammonium persulfate | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
TEMED | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 |
Total volume | 10 ml | 10 ml | 10 ml | 10 ml | 10 ml |
3.按上表顺序加各溶液配制不同浓度的下层胶，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，用异丙醇或水封平。待下层胶凝固后，将封平液倒干净，开始配制下层胶。
Water | 2.87 |
Bis/Acryl. 30% | 0.83 |
4×Tris.HCl/ SDS (0.5M, pH 6.8) | 1.25 |
10% ammonim persulfate | 0.05 |
TEMED | 0.005 |
Total volume | 5.0 ml |
按顺序加各溶液，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，不要有气泡，立即将梳子插入，凝固后将梳子拔出。
将制好的胶装入电泳槽，倒入电泳缓冲液，开始上样，每个孔上样1-40 μL（根据胶的厚度以及实验要求决定上样量）。记录上样次序，点Marker 。
电泳&转膜&封闭
1.上样结束后开始电泳，电泳时上层胶一般80V-90V，30 min；下层胶110V-120V，120 min（电泳一般采用恒压模式，电压不宜过高）。电泳结束后需要将胶放在PBST或TBST中润洗2 min，再放入转膜缓冲液中浸泡平衡。
2.将剪好的PVDF膜先在甲醇中浸泡2 min，后在ddH2O中浸泡2 min，最后在转膜缓冲液中浸泡平衡5 min。
3.垫子、膜和胶的放置：红、（＋）白架子、垫子、滤纸、膜、胶、滤纸、垫子、黑架子（－）、黑。转膜条带是从－到＋。
4.冰上转膜，恒流300 mA，120 min或80 mA以下过夜。转膜结束后将膜放入PBST或TBST中浸泡3-5 min，根据实验需要剪膜。
5.用5%脱脂牛奶（0.75 g奶粉+15 mL PBS或快速封闭液在室温封闭1-2 h。
6.洗膜，1×PBST或1×TBST，三次，每次5-10 min。
7.加一抗孵育（稀释度根据抗体效价而定一般需要摸索最佳条件），4℃，摇床，过夜。
8.室温洗膜，1×PBST（或1×TBST），三次，每次5-10 min。
9.加二抗孵育（HRP酶标二抗或荧光二抗），室温，2 h，摇床。
10.室温洗膜，1×PBST（或1×TBST），五次，每次5-10 min。
发光鉴定
1. 显色成像(ECL化学发光或荧光直接成像)。
2. 2.结果分析记录、拍照、扫描和保存。
3.洗膜，1×PBST（或1×TBST） 5 min，三次。
4.Stripping：将显色拍照后的PVDF膜放置在stripping液中，室温摇动30 min-60 min。
5.洗膜，1×PBST（或1×TBST） 5 min，三次。
6.可重复抗体孵育步骤，在同一张膜上检测其他的蛋白表达。一般可重复检测2-3次。
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