冰切-病理切片免疫组化服务（固定+包埋+冰切+染色）

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病理切片注意说明

冰冻病理切片是外科手术科室与病理科之间的一种急会诊方式。通过手术切去一小块组织，不经过常规固定脱水石蜡包埋等冗繁程序后，通过特制的OCT包埋剂，将组织冻结于-20度左右，切成薄片并染色，进行镜下观察，以帮助手术确定组织良恶性，切除方式，切除范围，确认不易肉眼辨认的组织等等。 

冰冻病理也有它的局限性：

1.确诊率不如石蜡切片，石蜡确诊率在99%左右，而冰冻依据水平不同，在90%-95%已经不错。

2.应用局限，对于脂肪类病变、淋巴瘤等需要免疫特性确定或不易切片的，冰冻很难以确定，故常常需要待石蜡结果；

3.对于烈性传染病病变常常不采用冰冻会诊。比如艾滋病、结核、梅毒等。避免医源性传播； 冰冻病理一般用于术中的判断，开了膛了需要半个小时之内就出结果，而且多数给的组织都不多，所以如果技术员的技术不好把片子做裂了、模糊了或是对比不清晰的话你就自求多福吧，通常是没有机会没有时间再切第二块的。

1、石蜡切片

1.1、取材要求

1）、组织固定越新鲜越好，组织离体后，需及时固定。原则上动物死亡后15分钟内完成取材并及时固定组织。

2）、组织标本不宜过大。由于所有的固定液都具有穿透力不强、侵透度不大等特点，凡是需要固定的组织，都不应太大太厚。

1.2、固定要求

1）、固定液的选择：10%福尔马林（4%甲醛）或10%中性甲醛是病理切片常规使用 的固定液，可以兼顾常规染色和免疫组织化学。

2）、固定液的用量：一般加入固定液的量与组织体积比为10：1～20：1。

3）、组织固定：固定时间不宜太短，也不宜太长。固定时间太短，会影响组织固定的效果；时间太长，福尔马林会形成聚甲醛，影响核的染色。固定时间主要

根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。

1.3、切片保存

做好的切片，经60℃烤片3-5小时后，可存放于4℃保存；若存放时间较长，最好存于-20℃。

2.1、取材要求

对于将要做冰冻切片的组织,取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存.

2.2、固定要求

样本冰冻切片后，应立即将切片放入甲醇、95%酒精、丙酮、4%多聚甲醛等固定液中固定

2.3、切片保存

固定好的切片，自然风干，密封好可置于-80℃、-20℃保存，但最好尽快用于后 续实验。

二、细胞样本

1、细胞块石蜡切片

对于一些细胞量较多的样品，可离心分离所需细胞，用中性甲醛固定后，制作成琼脂细胞块。然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。

2、细胞爬片

在孔板里做的细胞爬片，爬片取出后，用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛4℃固定15分钟，将表面液体吹干，置于-20℃保存。若短时间内开展实验，可在加固定液后， 于4℃冰箱中放置一段时间。根据研究目的，PBS洗涤可选择不做，如检测凋亡的TUNEL染色时就需避免洗涤，因凋亡的细胞在洗涤过程中有可能脱落。mRNA原位杂交：经4%多聚甲醛固定，固定液需用DEPC水配制。

3、细胞涂片

细胞学涂片常用的固定液有95%酒精、酒精-冰醋酸液、乙醚-酒精液和Carney’s液等， 其中95%酒精较为常用。

补充说明：

1）、实验常用的固定液为中性甲醛和4%多聚甲醛，能使大多数抗原保存良好，适用于免疫组织化学。一般认为4%多聚甲醛对检测mRNA的组织固定较为理想，因其既能有效地保存组织中的靶mRNA和组织的形态结构，也可使组织具有一定的通透性。因此做原位杂交时，经常选用4%多聚甲醛做固定液。丙酮的组织穿透性和脱水行更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4℃低温保存备用。若组织样本需做电镜实验，可用2.5%戊二醛来固定。

2）、荧光实验中，组织样本最好做成冰冻切片，因石蜡切片有较强的自发荧光，容易干扰实验结果。

3）、若客户提供切片，需了解其切片有无防脱处理。除HE实验外，其他病理实验的切片最好是防脱片，以免实验过程中出现掉片。

4）、脑组织做冰冻切片时，需先脱水处理，防止生成冰晶。脑组织先于4%多聚甲醛固定24小时（4℃）后，转移至20%蔗糖脱水处理至组织沉底（4℃），再转移至30%蔗糖脱水至沉底（4℃），之后可进行OTC包埋切片。

5）、若客户提供骨组织或钙化程度较高的组织进行实验，需进行脱钙处理。若委托我公司进行脱钙处理，则需要延长包埋切片所需时间（延长时间视具体样本而定）。

6）、骨组织、皮肤组织或脂肪含量较高的样品，实验中出现掉片的几率会较高（即使使用防脱载玻片的情况下）