WB实验试剂与过程注意事项

对于蛋白质印迹法，将膜与使用 5% w/v BSA 或脱脂奶粉的 1X TBS、0.1% Tween® 20稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜，同时轻轻振摇

从样品制备到检测，您进行蛋白质印迹法时所需要的试剂现均包含在一个便利的试剂盒

1.1 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #lvn10022)

2.20X Tris 盐缓冲液 (TBS)：( #C1057) 要制备 1 L 1X TBS：向 450 ml dH2O 中添加 50 ml 20X，然后混匀。

3.5X SDS 蛋白上样缓冲液(含DTT)：Blue Loading  (#C1026) ；或（C1026A）通过添加 1/10 体积的50 X DTT 至 1 体积的 5 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 5X 还原上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。

4. 5X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #C1024) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：向 450 ml dH2O 中添加 100 ml 5X 电泳缓冲液，然后混匀。

5.10X Tris-Glycine 转膜缓冲液：( #C1036) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。

6.10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：( #C1056) 要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。

7.脱脂奶粉：(#C1067)。

8.封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。

9. 洗涤缓冲液：(#C1056稀释1x) 1X TBST。

10. 牛血清白蛋白 (BSA)：(#C1022A)。

11一抗稀释缓冲液（C1037）：如一抗数据表上所示，含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。

12.预染蛋白质标准品，宽范围 (11-180 kDa)：(#lvn150)。

13.印迹膜和纸：(millpore PVDF, ISEQ00010) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。

14.HRP 偶联二抗：抗兔 (#C1061)；抗小鼠(#C1062)。

15. 检测试剂： ECL发光液 (#C1006)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

样品制备、SDS-PAGE 和转移

1.添加含有调节分子的新鲜培养基，使其在预定的时间内对细胞进行处理。

2.从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。

3.加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞（6 孔板每孔加 100 µl 或直径为 10 cm 盘中加 500 µl）。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

4.超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

5.取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。

6.微量离心机内离心 5 分钟。

7.取20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

注：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，5 µl/泳道）上样以验证电转移和将生物素化的蛋白质分子量标准品 (#7727，10 µl/泳道）上样以确定分子量。

电转移至硝酸纤维素膜 (#Millipore HATF00010 硝酸纤维素膜（NC膜）)。

C. 膜封闭和抗体孵育

封闭和抗体孵育

注：以下所用试剂体积数适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整体积。

I. 膜封闭

1.（可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

2.将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。

3.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

II.一抗孵育

根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

对于无偶联的一抗

1.将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

3.按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗，按 1:2000），同时加入anti-biotin, HRP-linked Antibody，按 1: 1000-1:3000）以检测生物素化的蛋白质标准品。置于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。

4.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

5.继续进行检测（D 部分）。

对于偶联有HRP 的一抗

1.将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

3.与检测生物素酰化蛋白质标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody ，按 1: 1000-1:3000）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。

4.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

5.继续进行检测（D 部分）。

对于生物素化的一抗

1.将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

3.将膜与 Streptavidin-HRP 以适宜的稀释度）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。

4.用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

5.继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

蛋白质检测

1.将膜与 10 ml LumiGLO®（0.5 ml 20X LumiGLO® 0.5 ml 20X 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ （5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温下孵育1 分钟并不时轻轻搅动。

2.将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光时间中可以看出适当的曝光时间。

注：由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的 2 小时内会减弱。